Карнозин как фактор эндоэкологической защиты организма от повреждений, вызванных окислительным стрессом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.16, кандидат биологических наук Беляев, Михаил Сергеевич

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Беляев, Михаил Сергеевич

Цели и задачи исследования.

Развитие окислительного стресса, индуцированного экологическими факторами.

Свободные радикалы. Активные формы кислорода.

Гипоксия — экологический фактор окружающей природной и техногенной среды.

Повреждения, возникающие в митохондриях при окислительном стрессе.

Перекисное окисление липидов (ПОЛ).

Кислородный (дыхательный) взрыв.

Состояние мембран эритроцитов при окислительном стрессе.

Система антиоксидантной защиты. Утилизация свободных радикалов в клетке.

Пути обеспечения энергетического обмена при окислительном стрессе. Роль сукцинатдегидрогеназы

Роль супероксиддисмутазы как основного фермента антиоксидантной защиты в обеспечении устойчивости организма к воздействию окислительного стресса.

Эндоэкологические факторы, индуцирующие развитие окислительного стресса.

3-нитропропионовая кислота, ее воздействие на головной мозг.

Гомоцистеин и его метаболизм.

Сосудистые патологии головного мозга. Хроническая дисциркуляторная энцефалопатия.

Оценка когнитивных функций пациентов, страдающих ДЭ. Метод вызванных потенциалов Р300.

Обоснование целесообразности использования природных и синтетических антиоксидантов в качестве лекарственных средств.

Карнозин - природный нейропротектор.

Материалы и методы экспериментальных и клинико-биохимических исследований.

Острая гипобарическая гипоксия, отягощенная введением 3-нитропропионовой кислоты.

Экспериментальная модель острой гипоксической гипоксии.

Тестирование физиологической активности крыс.

Эксперименты по введению 3-НПК.

Модель ишемии, отягощенной введением гомоцистеиновой кислоты (ГЦК).

Двухэтапная окклюзия 3 магистральных сосудов головы крыс.

Эксперименты по введению ГЦК и карнозина.

Эксперименты по оценке памяти и способности к обучению у животных в водном лабиринте Морриса

Проведение биохимических исследований (эксперименты in vivo).

Приготовление гомогенатов головного мозга.

Получение митохондриальной фракции из ткани мозга крысы.

Определение содержания белка в пробах по методу Лоури.

Определение активности сукцинатдегидрогеназы в митохондриальной фракции головного мозга животных.

Определение активности моноаминоксидазы в гомогенатах головного мозга животных.

Определение активности супероксиддисмутазы в гомогенатах головного мозга животных.

Проведение биохимических измерений в рамках клинико-биохимического исследования.

Определение активности Cu/Zn-супероксиддисмутазы в эритроцитах человека.

Определение концентрации гемоглобина.

Хемилюминесценцш липопротеинов сыворотки крови, индуцированная ионами двухвалентного железа

Исследование физико-химических характеристик мембран лейкоцитов человека с помощью флуоресцентного зонда пирена.

Кислородный (дыхательный) взрыв.

Определение гомоцистеина в плазме крови методом ВЭЖХ.

Определение гомоцистеина в плазме крови иммунологическим методом (Axis1,Ki).

Оценка когнитивных функций мозга пациентов методом вызванных потенциалов Р300.

Математическая обработка данных.

Глава 1. Влияние карнозина на устойчивость клеточных структур крови человека в опытах in vitro.

Оценка действия карнозина в условиях Fe2+-индуцированной хемипюминесценции липопротеинов сыворотки крови человека.

Влияние карнозина и гомоцистеина на «дыхательный взрыв» лейкоцитов человека, индуцированный опсонизированным зимозаном in vitro.

Кислотный гемолиз, отягощенный ГЦК.

Эксимеризация пирена в суспензии лейкоцитов донорской крови.

Глава 2. Действие карнозина на крыс Вистар в условиях гипобарической гипоксии, отягощенной 3нитропропионатом.

Глава 3. Оценка протекторного эффекта карнозина на модели 3-сосудистой ишемии головного мозга на фоне введения гомоцистеиновой кислоты.

Глава 4. Карнозин увеличивает устойчивость к эндоэкологическому стрессу у пациентов с хронической дисциркуляторной энцефалопатией.

Влияние карнозина на окислительную устойчивость липопротеинов и эритроцитов крови и эффективность иммунокомпетентной системы у пациентов с хронической дисциркуляторной энцефалопатией.

Активность Cu/Zn — супероксиддисмутазы (СОД) в эритроцитах крови у больных сДЭ.

Дыхательный взрыв в суспензии лейкоцитов, индуцированный опсонизированным зимозаном.

HCl-индуцированный гемолиз эритроцитов.

Концентрация общего гомоцистеина в плазме крови пациентов сДЭ.

Оценка неврологического состояния и когнитивных функций мозга пациентов с хронической дисциркуляторной энцефалопатией.

Список публикаций по теме диссертации.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Экология», 03.00.16 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Карнозин как фактор эндоэкологической защиты организма от повреждений, вызванных окислительным стрессом»

В процессе жизнедеятельности организма клеточный гомеостаз подвергается воздействию различных повреждающих факторов как экзогенного, так и эндогенного происхождения. В клетке существуют механизмы, обеспечивающие стабильность внутренней среды организма, которые могут рассматриваться как эндоэкологические. Подавляющее большинство всех живых организмов, принадлежащих к сложным экологическим системам, являются кислород-потребляющими. Многие метаболиты способны вызывать нарушения, лежащие в основе необратимых изменений обмена веществ. Такие соединения, являющиеся факторами риска, в частности, нейродегенеративных процессов, могут служить показателями как нарушений обмена веществ, так и его нормализации в процессе лечения. Такого рода факторы являются сенсорами эндоэкологического состояния гомеостаза.

К числу факторов, индуцирующих развитие системного окислительного стресса в тканях, относятся гомоцистеин и продукты его спонтанного окисления (главным образом, гомоцистеиновая кислота), уровень которых в кровяном русле резко возрастает при острых нарушениях мозгового кровообращения. Эти же соединения являются известными факторами риска, осложняющими течение хронических сосудистых заболеваний головного мозга.

Особая чувствительность к окислительному стрессу головного мозга, ткань которого наиболее активно потребляет кислород, вызвана повышенной окисляемостью мембранных липидов нейрональной ткани и относительно низкой активностью эндогенной антиоксидантной системы. Таким образом, эндоэкологическое факторы баланса между образованием и нейтрализацией активных форм кислорода (АФК) являются показателем устойчивости мозга к неблагоприятным факторам.

Окислительный стресс и истощение эндогенной антиоксидантной системы могут рассматриваться в качестве факторов эндоэкологического стресса.

Эндоэкология — раздел биоэкологи, то есть экологии в первоначальном понимании термина, то есть часть биологии, изучающая отношения организмов (особей, популяций, биоценозов) между собой и окружающей средой. Вместе с тем - это биологическая основа (базис) современной экологии. В структуре современной экологии, предложенной Н.Ф. Реймерсом (Реймерс, 1994), биоэкология выглядит следующим образом: она включает в себя системную экологию, экологию систематических групп, эволюционную экологию и палеоэкологию. Системная экология, в свою очередь, представляет собой совокупность научных дисциплин, исследующих взаимоотношения системных биологических структур (биотических систем) между собой и с окружающей их средой. В зависимости от иерархического уровня организации биологических структур (биотических систем) биоэкологию подразделяют на эндоэкологию и экзоэкологию. Эндоэкология, в свою очередь, подразделяется на молекулярную экологию (в том числе экологическую генетику) и физиологическую экологию (экология индивида).

В свете научных интересов молекулярной и физиологической эндоэкологии изучение механизмов регуляции гомеостаза как многоклеточного организма в целом, так и клеточных структур, входящих в его состав, является одной из важнейших задач этой науки.

Как ни странно, в научном мире понятия «экология» и «окислительный стресс» имеют больше точек соприкосновения, чем может показаться с первого взгляда. Так, именно одна из основных экологических проблем человечества — ядерное оружие и атомная энергетика — послужила поводом к активному изучению свободнорадикальных процессов. Взрыв первой атомной бомбы в США в 1945 г. породил много новых вопросов, в том числе и о влиянии радиации на биологические системы. Исследования 50-60-х годов прошлого столетия показали, что действие ионизирующего излучения реализуется посредством образования чрезвычайно реакционноспособных свободных радикалов, возникающих при расщеплении молекул воды (Н20 -> радиация -> нГ + ОН* + е). Теория цепного радикального окисления органических молекул, разработанная группой ученых во главе с H.H. Семеновым, оказалась применимой и в случая окисления липидов, входящих в состав клеточных мембран. В дальнейшем Б.Н. Тарусов разработал концепцию о свободнорадикальной патологии, а академик Н.М. Эммануэль впервые высказал предположение, что повреждения, вызываемые свободными радикалами, могут играть важную роль в процессе канцерогенеза. Здесь необходимо отметить, что раковые заболевания являются одной из основных причин смертности. Показано, что именно свободным радикалам отводится важная роль в развитии процесса старения (Меньщикова и соавт., 2006).

Некоторые исследователи даже склонны выделять роль свободнорадикальных процессов в биологических системах, которые неразрывно связаны с понятием «окислительный стресс», в отдельную научную дисциплину - свободнорадикальную биологию (Меньщикова и соавт., 2006).

В живых организмах имеется многокомпонентная антиоксидантная система (АО), необходимая для контроля продукции активных форм кислорода (АФК) и предотвращения развития свободнорадикальных реакций. Она представлена ферментами антирадикальной защиты (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза), а также многочисленными низкомолекулярными антиоксид антами.

Согласованная работа всех компонентов АО системы держит под постоянным контролем как образование, так и превращение АФК в клетках. Для мозга характерно низкое содержание основных компонентов АО защиты с одной стороны, и высокое содержание субстратов (полиненасыщенных жирных кислот) и катализаторов (в основном ионов металлов с переменной валентностью - меди и железа) свободнорадикальных реакций. Кроме того, мозг является органом, наиболее активно потребляющим кислород, что в целом и обусловливает его высокую избирательную чувствительность к свободнорадикальным процессам. Многие заболевания центральной нервной системы (ЦНС) (сосудистые, нейродегенеративные и другие) протекают на фоне длительно существующего ОС, который в настоящее время рассматривается как одна из основных причин необратимой гибели мозга.

В норме свободные радикалы участвуют в выполнении важнейших физиологических процессов в организме. Супероксид-анион, гидроксид-радикал и перекись водорода могут участвовать в поддержании вазоконстрикторного-вазодилятаторного (сужение-расширение кровеносных сосудов) баланса, обусловливающего гетерогенность и изменяемость органного кровотока. При этом супероксид-анион не оказывает прямого действия на гладкомышечные клетки сосудов, но способен инактивировать МО-радикал, являющийся эндотелий-зависимым релаксирующим фактором. Н2О2 и ОН", напротив, индуцируют вазодилатацию. Чрезвычайно велика роль активных форм кислорода в воспалительных реакциях, которые имеют место практически при всех типах повреждений тканей, в том числе и при ишемии.

Свободнорадикальное окисление является одним из естественных механизмов модификации липидного состава клеточных мембран, обусловливающим изменения их функциональных характеристик (Кругл и ков и соавт. 1995). Образование N0 из аргинина происходит с участием молекулярного кислорода и НАДФН2. N0 выполняет чрезвычайно разнообразные физиологические функции, принимая участие в модуляции сосудистого тонуса, в механизмах памяти и в реакциях воспаления. N0 в норме является антиоксидантом, поскольку он реагирует с липофильными пероксильными радикалами, важнейшими и широко распространенными соединениями в биологической цепи реакций пероксидации липидов, приводя к генерации значительно более стабильных алкил-пероксинитратов (ЬООЫО), что позволяет N0 остановить пероксидацию липидов.

Особую роль АФК играют в поддержании жизнедеятельности организма в неблагоприятной окружающей среде, в адаптивных реакциях, в обеспечении работы протекторных систем организма — в процессах, обеспечивающих поддержание гомеостаза, физиологический статус. При этом показано, что избыточная генерация активных форм кислорода (АФК) приводит нарушению клеточного гомеостаза и развитию патологических процессов в организме (Владимиров, 1972; Козлов, 1973; Болдырев, 1996).

Одними из наиболее агрессивных химических структур являются гидроксид-радикалы, которые реагируют с большой скоростью почти со всеми молекулами, находящимися в живой клетке, в частности, вызывая химическое повреждение дезоксирибозы, пуриновых и пиримидиновых оснований, мембранных липидов и углеводов, что приводит к каскаду реакций, вызывающих повреждение митохондриальной элетронтранспортной системы, нарушению внутриклеточного гомеостаза Са2+, индукции протеаз, увеличению пероксидации липидов в мембране и в финале — смерть клетки (УоисИт е! а1, 1993).

Нарушение баланса между образованием АФК и их нейтрализацией компонентами АО системы приводит к увеличению уровня радикальных соединений и истощению эндогенной АО системы. Такое состояние называется окислительным стрессом (ОС).

Окислительный стресс - явление, наблюдаемое при таком широко распространенном заболевании, как ишемический инсульт (инфаркт мозга). Это - локальная ишемия головного мозга, сопровождающаяся проявлением очаговых неврологических нарушений. Ишемия мозга может быть вызвана тромбозом или эмболией вне- либо внутричерепных артерий, в редких случаях — гипоперфузией мозга вследствие системных гемодинамических нарушений. По данным Всемирной федерации неврологических обществ, ежегодно в мире регистрируется до 15 млн. случаев инсультов. В РФ заболеваемость инсультом составляет 3,4 на 1000 человек в год, то есть около 450000 случаев в год. (Яхно, 2005).

В 20—30% случаев инсульту предшествуют транзиторные ишемические атаки (преходящие нарушения мозгового кровообращения), характеризующиеся острым развитием неврологических нарушений и их регрессом в течение суток. Другие основные факторы риска ишемического инсульта включают увеличение возраста, артериальную гипертензию, сахарный диабет, гиперхолестеринемию, атеросклеротический стеноз сонных артерий, курение, сердечнососудистые заболевания.

Состояние окислительного стресса возникает тогда, когда возобновляется ранее нарушенное кровоснабжение того или иного участка головного мозга.' При реперфузии наблюдается реоксигенация тканей, и, как следствие, образование большого количества АФК, оказывающих свое разрушающее действие на клетки головного мозга, находящиеся в так называемой зоне «ишемической полутени». К этой зоне относится большинство клеток, гибель которых наступает в течение 6-12 часов после перенесенного ишемического эпизода в результате сложного каскада биохимических реакций. Пути предотвращения гибели этих клеток — с одной стороны, возобновление поступления кислорода в эту зону, а с другой стороны - защита нейронов от окислительного повреждения, возникающего как раз из-за образования АФК. Для осуществления нейропротекции теоретически нужно применение препаратов с антиоксидантной активностью, химических соединений, уменьшающих активность возбуждающих медиаторов, блокаторов кальциевых каналов. Однако известно, что применение нейропротекторов имеет свои ограничения, и они могут быть эффективны лишь в течение первых нескольких часов после возникновения неврологических симптомов (Гусев, Скворцова, 2001). В связи с этим поиск новых препаратов, способных воспрепятствовать процессам, вызывающим нейрональную гибель, и обеспечить восстановление функции мозга, является актуальной задачей.

Окислительный стресс (ОС) может быть вызван как эндогенными, так и экзогенными неблагоприятными факторами — загрязняющими веществами окружающей среды, ионизирующим излучением, действием чужеродных организмов, влиянием экстремальных температур, недостатком кислорода. В соответствии с вышеизложенным, ОС можно рассматривать как неблагоприятный экологический фактор внутренней среды организма, называемый нами эндоэкологическим стрессом.

К числу химических факторов, способствующих развитию системного окислительного стресса в тканях, относятся гомоцистеин и продукты его спонтанного окисления (главным образом, гомоцистеиновая кислота), уровень которых в кровяном русле резко возрастает при нарушениях мозгового кровообращения (Yap, 2003; Зорилова, 2006). Как правило, при хронических сосудистых заболеваниях головного мозга наблюдается гипергомоцистеинемия различной степени выраженности, вызванная нарушениями метаболизма, происходящими под влиянием разнообразных экзо- и эндогенных факторов. Другой химический агент, 3-нитропропионовая кислота (3-НПК) является токсином; в мозге он необратимо ингибирует митохондриальную сукцинатдегидрогеназу и тем самым усугубляет функционально-метаболические нарушения мозга. В настоящее время действие этих соединений в условиях гипоксического и ишемического повреждения как мозга, так и организма в целом исследовано недостаточно. Актуальным вопросом является и поиск природных нейропротекторов в условиях гипоксии/ишемии, отягощенной токсическим действием эндогенных и экзогенных химических агентов.

Целесообразным подходом к регуляции окислительного стресса в условиях гипоксии/ишемии головного мозга является применение антиоксидантов природного происхождения (Федорова и соавт., 2001; Boldyrev, 2006). С этой точки зрения перспективным соединением может быть природный нейропептид карнозин ф-аланил-Ь-гистидин). Являясь специфическим компонентом возбудимых тканей позвоночных животных, карнозин обнаруживает способность защищать мозг от окислительного стресса и его последствий в различных экспериментальных моделях fBoldyrev, Severin, 1990; Болдырев, 1992; Boldyrev. 2001). Он уменьшает экзайтотоксичность NMDA-рецепторов, предотвращает индукцию нейрональной смерти при действии неблагоприятных факторов, смягчает неврологическую симптоматику и уменьшает смертность животных после экспериментальной ишемии головного мозга (Федорова и соавт., 2002).

В клинико-биохимических исследованиях показано участие окислительного стресса в патогенезе гипоксических и ишемических поражений головного мозга (Суслина, 2000). Оценка возможности применения карнозина в качестве дополнительного лечения больных с хронической дисциркуляторной энцефалопатией (ДЭ) является актуальной задачей.

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилась характеристика окислительных повреждений тканей в условиях эндоэкологического стресса и разработка подходов к нормализации метаболизма с помощью природного нейропептида карнозина.

Задачи исследования включали: 1. характеристику защитного эффекта карнозина на структурные элементы крови человека на фоне действия гомоцистеиновой кислоты (ГЦК) в опытах in vitro;

2. исследование терапевтического влияния карнозина на биохимические и физиологические проявления острой гипобарической гипоксии, отягощенной действием 3-НПК у крыс линии Вистар;

3. оценку протекторного эффекта карнозина на модели 3-сосудистой ишемии головного мозга на фоне введения ГЦК;

4. оценку терапевтического действия карнозина в комплексном лечении пациентов с хронической дисциркуляторной энцефалопатией (ДЭ).

Научная новизна. В работе описаны модели сочетанного действия различных эндоэкологических факторов, включающих гипоксию/ишемию, отягощенную воздействием 3-НПК или гомоцистеиновой кислоты.

Нейропептид природного происхождения карнозин был впервые применен нами в качестве дополнительного фактора лечения пациентов, страдающих ДЭ.

В работе показано, что защитные эффекты карнозина как на структурные элементы крови, так и на организм в целом, не ограничиваются его антиоксидантными свойствами, а включают мембраностабилизирующее и иммуномодулирующее действие. Выявлена способность карнозина улучшать когнитивные функции мозга у пациентов с ДЭ.

Проведенное исследование выявило многофункциональность карнозина как модулятора биологических структур.

Научно-практическая значимость. Обнаруженное нами положительное влияние карнозина при его введении животным в постгипоксический/постишемический период позволяют рекомендовать его для лечения больных с различными гипоксическими состояниями, а также для реабилитации лиц, подвергшихся воздействию гипоксии, и спортсменов в периоды интенсивных нагрузок.

Результаты проведенного клинико-биохимического исследования позволяют считать целесообразным введение карнозина в схему лечения пациентов, страдающих ДЭ.

Это исследование является фрагментом плановой научно-исследовательской темы клинического отделения и лаборатории биохимии.

Работа одобрена этическим комитетом, этическим комитетом был разработан и утвержден протокол, пациенты давали письменное информированное согласие на включение карнозина в виде БАД в их схему лечения. Состояние пациентов оценивались неврологами, группы однородны, все пациенты получали терапевтическое лечение. Для доказательства эффективности препарата (с точки зрения показательной медицины) был использован двойной слепой плацебо-контролируемый метод.

Основные положения, выносимые на защиту. Эффекты карнозина в условиях эндоэкологического повреждения не ограничиваются его антиоксидантными свойствами; на моделях in vitro карнозин проявляет мембраностабилизирующее действие на структурные элементы крови человека.

Карнозин оказывает защитное и регуляторное действие на биохимические и физиологические параметры, изменяющиеся в результате сочетанного действия эндоэкологических факторов - острой гипобарической гипоксии и 3-НПК - у крыс линии Вистар.

З-НПК и ГЦК являются значимыми факторами, усугубляющими развитие ОС в условиях гипоксии/ишемии головного мозга крыс Вистар. Карнозин проявляет свойства нейропротектора, предотвращая развитие неврологических и двигательных нарушений у животных, что коррелирует с нормализацией биохимических показателей.

Введение карнозина в схему лечения пациентов с ДЭ (дополнительно к базовой терапии) повышает уровень эндогенной антиоксидантной защиты, эффективность иммунокомпетентной системы, а также проявляет мембранопротекторное действие. Эти эффекты сопровождаются положительным действием карнозина на когнитивные функции мозга.

Апробация работы. Работа апробирована и рекомендована к защите 25 сентября 2008 г. на заседании кафедры системной экологии экологического факультета РУДН. Материалы диссертации были представлены на конференциях «Актуальные проблемы экологии и природопользования» (экологический факультет РУДН) в 2003 и 2005 гг., на XI Международном симпозиуме «New frontiers of neurochemistry and neurophysics on diagnosis and treatment of neurological diseases» в 2003 г. в г. Мартине (Словакия), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет) в 2008 г., на I Национальном Конгрессе по болезни Паркинсона и расстройствам движений, 2008 г. (Москва).

Публикации: по теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в список ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и иллюстрирована 15 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, раздела, отражающего результаты собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы, состоящего из 104 отечественных и 78 зарубежных источников.